Setiap mikroorganisme mengalami proses metabolism untuk tumbuh dan berkembang biak. oleh karena itu diperlukan suatu substrat yang disebut dengan media pertumbuhan.
Kebutuhan nutrisi mikroorganisme beraneka ragam sehingga diperlukan media yang sesuai untuk masing-masing jenis mikroorganisme. Menumbuhkan mikroorganisme di luar habitat aslinya, memerlukan media pertumbuhan yang sesuai sehingga akan menunjang pertumbuhannya. Media pertumbuhan yang digunakan harus memenuhi syarat dalam hal komposisi nutrisi, tidak mengandung zat penghambat, menyediakan lingkungan fisik yang sesuai dan media harus steril. Penggunaan media yang steril tidak lepas dari tindakan-tindakan untuk membebaskan media atau alat dari kontaminan. Hal tersebut memerlukan suatu teknik yang dinamakan dengan dterilisasi. Pemilihan teknik sterilisasi harus didasarkan atas sifat media atau alat dan tujuan dilakukannya sterilisasi.
Teknik dan mekanisme sterilisasi harus dapat dipahami, demikian juga dengan cara pembuatan media sehingga dapat memperlancar kegiatan-kegiatan yang berhubungan dengan analisis dan penelitian di laboratorium khususnya di bidang mikrobiologi. Mikroorgnaisme adalah organisme yang berukuran mikroskopik dengan diameter kurang dari 0,1 mm dan tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena mikroorganisme memiliki sifat yang mikroskopik maka hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop (Syahrurachman, dkk., 1994). Mikroorgnisme dibiakkan di laboratorium pada bahan dan nutrisi yang disebut dengan media pertumbuhan. Penggunaan media pertumbuhan bergantung pada beberapa faktor, antara lain adalah jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan (Pelczar dan Chan, 1986). Media pertumbuhan merupakan nutrisi yang diperlukan untuk menunjang pertumbuhan suatu mikroorganisme pada skala laboratorium.
Terdapat berbagai macam media pertumbuhan yang dapat digunakan di laboratorium, namun untuk media umum yang biasa digunakan antara lain adalah Potato Dextrose Agar (PDA), Nutrient Agar (NA), dan Nutrient Broth (NB). PDA merupakan media umum yang digunakan untuk menumbuhkan fungi. NA merupakan media umum yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri. NB merupakan media umum berbentuk cair digunakan sebagai media pengaya untuk menumbuhkan mikroorganisme dalam jumlah besar (Abedon,. Tanpa Tahun). Bahan yang digunakan untuk membuat PDA adalah kentang, dekstrosa (glukosa) dan agar.
Menurut Poedjiadi (1994), kentang merupakan sumber karbohidrat yang di dalamnya mengandung pati atau amilum. Butiran pati akan membentuk larutan koloid yang kental apabila dipanaskan. Menurut Ketchum (1988), karbohidrat dalam media pertumbuhan akan memberikan suplai energi pada proses metabolism mikroorganisme. Glukosa merupakan aldoheksosa dan sering disebut sebagai dekstrosa karena mempunyai sifat dapat memutar cahaya terpolarisasi ke arah kanan (Poedjiadi, 1994).
Menurut Todar (1998), glukosa (dekstrosa) di dalam media pertumbuhan berfungsi sebagai suplai karbon dan juga energi. Sedangkan agar yang merupakan kompleks karbohidrat tidak berfungsi nutrient namun sebagai pemadat media (Pelczar dan Chan, 1981). Media NA terdiri atas ekstrak (air kaldu) daging sapi tanpa lemak atau beef extract, pepton, dan agar. Media NB memiliki komposisi yang sama dengan media NA, namun tanpa penambahan agar. Menurut Todar (2002), ekstrak daging sapi berfungsi dalam menyuplai vitamin untuk pertumbuhan mikroorgansme sedangkan pepton sebagi sumber nitrogen organik, sulfur, dan pospat.
Sama halnya pada media PDA, agar pada media NA berfungsi sebagai pemadat media. Media pertumbuhan dapat dikatakan baik apabila memenuhi persyaratan yaitu mudah digunakan atau didegradasi oleh mikroorganisme, memiliki komposisi nutrisi yang cukup untuk pertumbuhan, memiliki daya larut dalam air, memiliki toksisitas, memiliki lingkungan fisik yang sesuai (meliputi temperatur dan pH: 6-9) (Anonymous, Tanpa Tahun). Sterilisasi adalah proses yang digunakan untuk membebaskan substrat atau obyek dari mikroorganisme dari kontaminan. Sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakan pemanasan kering dan pemanasan basah. Selain itu dapat juga dilakukan dengan filtrasi menggunakan filter yang berfungsi menghambat pertumbuhan kontaminan. Teknik praktis dari sterilisasi adalah meniadakan kemungkinan dari sel tunggal mikroorganisme yang masih hidup pada proses infinitesimal (Ketchum, 1988).
Teknik sterilissi dengan pemanasan kering dapat membunuh spora bila dilakukan selama lebih kurang 2 jam dengan suhu 160oC pada oven. Pemanasan basah lebih efektif daripada pemanasan kering dalam mematikan endospore bakteri. Penggunaan autoclave merupakan salah satu cara sterilisasi dengan pemanasan basah. Autoclave merupakan alat yang essensial dimana alat tersebut menggunakan prinsip tekanan dengan uap air panas (Ketchum, 1988).
Sterilisasi normal dengan menggunakan autoclave berkisar antara 12-15 menit pada suhu 121oC dengan tekanan 1-2 atm. Sterilisasi dengan skala besar dapat mencapai 30-40 menit. Apabila suhu diperkirakan telah mencapai batas, autoclave dapat dimatikan. Pengambilan alat atau media yang disterilisasi dapat dilakukan setelah jarum pada autoclave menunjukkan angka nol, agar materi yang telah disterilisasi tidak pecah atau mengalami kerusakan akibat perubahan tekanan secara mendadak (Buroows, dkk., 1986). Pembuatan Media Skala Laboratorium 1. Pembuatan Media Pada pembuatan media, bahan dasar yang digunakan adalah kentang (untuk PDA) dan daging sapi tanpa lemak (untuk NA dan NB). Kentang dan daging masing-masing dipotong tipis-tipis kemudian dididihkan.
Pemotongan bahan bertujuan untuk memperluas permukaan bahan sehingga didapatkan ekstrak bahan dengan nitrisi yang maksimal. Proses pendidihan bahan dilakukan selama 10-25 menit dengan mempertahankan volume akuades agar volume tetap stabil sehingga komposisi media tidak berubah. Campuran bahan dan akuades yang telah didihkan selanjutnya disebut sebagai ekstrak. Ekstrak kentang dan daging masing-masing disaring sebelum ditambah dengan bahan lainnya. Penyarinagan bertujuan untuk menghindari adanya endapan bahan yang nantinya dapat mengganggu pengamatan terhadap koloni mikroorganisme yang tumbuh pada media tersebut. Pembuatan media PDA menggunakan ekstrak kentang yang telah disaring.
Ekstrak kentang tersebut dididihkan kembali dan dicampur dengan dekstrosa dan agar. Proses pendidihan kedua ini bertujuan untuk melarutkan semua bahan hingga terbentuk media yang homogen. Pembuatan media NA dan NB menggunakan ekstrak daging tanpa lemak yang telah disaring. Untuk media NA ekstrak daging tanpa lemak selanjutnya ditambah dengan peptone dan agar sedangkan untuk media NB tanpa penambahan agar. Pendidihan campuran bahan dilakukan lagi untuk melarutkan semua bahan sehingga didapatkan media yang benar-homogen.
Pendidihan tidak boleh dilakukan terlalu lama, hanya sampai pendidihan pertama saja agar tidak terjadi denaturasi protein (utamanya pada pepton). Penggunaan daging tanpa lemak pada proses pembuatan media dilakukan agar media tidak terkopntaminasi oleh minyak yang berasal dari lemak daging. Adanya kandungan minyak pada media dapat menyebabkan media tidak homogen sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Media agar dapat digunakan sesuai kebutuhan sehingga setelah proses pembuatan, media bisa diletakkan di tabung reaksi, erlenmeyer atau botol. Untuk mendapatkan media miring dan media tegak, media dapat ditempatkan di tabung reaksi.
Penggunaan media pada tabung reaksi ini biasanya untuk menumbuhkan mikroorganisme sebagai stock culture. Untuk keperluan isolasi, media bisa ditampung dulu dalam erlenmeyer.
